Western blotting檢測(cè)試劑盒(DAB)
簡(jiǎn)要描述:貨 號(hào):P1050名 稱:Western blotting檢測(cè)試劑盒(DAB)規(guī) 格:10T價(jià) 格:860.00
產(chǎn)品型號(hào):
所屬分類:其他自產(chǎn)即用試劑
更新時(shí)間:2024-01-07
廠商性質(zhì):經(jīng)銷商
P1010 | Western blotting(小鼠IgG)DAB檢測(cè)試劑盒 | 920 |
P1020 | Western blotting(兔IgG)DAB檢測(cè)試劑盒 | 920 |
P1030 | Western blotting(山羊IgG)DAB檢測(cè)試劑盒 | 920 |
試劑盒組成
1. 封閉試劑:30g(可配制400ml)脫脂奶粉及其他蛋白,緩沖鹽等混合物。
2. 10倍濃縮抗體稀釋液,50ml。
3. HRP標(biāo)記二抗,0.5ml,效價(jià)1:400。
4. DAB顯色液(20×),5ml A+5ml B。
原理:
SDS-PAGE電泳后,蛋白質(zhì)按照分子量大小分離,轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)后,固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì),以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng),再與酶標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng),經(jīng)過底物顯色以檢測(cè)電泳分離的特異性的蛋白。
操作步驟:
常規(guī)電泳轉(zhuǎn)膜后,
1) 清洗轉(zhuǎn)印膜:將膜剝離下后,作好標(biāo)記,一般在左上角剪一缺口。室溫用TBS-T漂洗3次每次5min,以盡量洗去轉(zhuǎn)印膜上的SDS,防止影響后面的抗體結(jié)合。
2) 按5g封閉試劑加100ml雙蒸水計(jì),配制膜封閉液,配好的膜封閉液為乳白色懸液,將漂洗過的轉(zhuǎn)印膜,封閉液內(nèi),搖床震動(dòng),室溫封閉30min。 A@ 3) 用TBS-T ,PH7.6洗液,室溫漂洗3次每次5min。
3)將10×抗體稀釋液用雙蒸水稀釋成1×(10ml 10×抗體稀釋液加入90ml雙蒸水,混勻,可4℃保存三個(gè)月)。此稀釋液可作為一抗和二抗的稀釋液。
4)用1×的抗體稀釋液稀釋抗體。根據(jù)用量以及一抗的推薦稀釋濃度來稀釋一抗。將雜交膜放入雜交袋中,加入一抗工作液,封口,4℃孵育過ye或37℃搖動(dòng)孵育2h。此用過的抗體一般可回收第二天再使用一次。注:如果所加一抗不同,可在此步將膜沿電泳方向剪成條,分別作好標(biāo)記,分開孵育。
5)用TBS-T ,PH7.6洗液,室溫漂洗3次每次5min。
6)用稀釋好的抗體稀釋液稀釋抗體。根據(jù)用量,按10ml抗體稀釋液加入10ulHRP標(biāo)記二抗的比例,配制二抗工作液。將雜交膜放入雜交袋中,加入加入二抗工作液,封口,4℃孵育過ye或37℃搖動(dòng)孵育2h。此用過的抗體一般可回收第二天再使用一次。
7)用TBS-T ,PH7.6洗液,室溫漂洗3次每次10min。
8)配制DAB顯色:根據(jù)用量,取TBS-T 4ml,加入DAB顯色液A、DAB顯色液B各200ul,混勻,加在膜正面,室溫下顯色。在目標(biāo)條帶顯出后,而且背景未出時(shí),放入水中終止顯色。
注意事項(xiàng):
1, 請(qǐng)根據(jù)一抗來源選擇試劑盒。括號(hào)里面代標(biāo)一抗的來源而不是標(biāo)本的來源。
2, western blotting DAB顯色法操作簡(jiǎn)單,但其敏感性與ECL發(fā)光發(fā)有一定的差距,一般只適用于豐度較高的蛋白。
3, 可以根據(jù)顯色結(jié)果來優(yōu)化實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間。如背景過深,可延長膜封閉時(shí)間,加長zui終漂洗次數(shù)與時(shí)間。如果條帶過弱,可延長抗體孵育時(shí)間。
4, 如果*沒有條帶,請(qǐng)檢查前期蛋白處理及實(shí)驗(yàn)過程, 如果確認(rèn)無誤,反復(fù)兩次依舊無結(jié)果,請(qǐng)換用ECL發(fā)光法顯色。
5, TBS-T(0.01M)配制方法:稱取NaCl 8.5g ,Tris 1.21g ,用800ml的雙蒸水溶解,用鹽酸調(diào)PH到7.6,再加入0.5mlTween-20,用雙蒸水 加至1000ml,混勻即可。(也可按照自己的配制習(xí)慣來配制)
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