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線粒體DNA提取試劑盒

線粒體DNA提取試劑盒

簡要描述:貨  號:D0215
名  稱:線粒體DNA提取試劑盒
規(guī)  格:50T/100T
價  格:1280.00/2360.00

產(chǎn)品型號:

所屬分類:其他自產(chǎn)即用試劑

更新時間:2024-01-07

廠商性質(zhì):經(jīng)銷商

詳情介紹

線粒體DNA提取試劑盒

 一,試劑盒組份

組份

D0215 (50T)

D0215 (100T)

細(xì)胞裂解液

50 mL

100 mL

線粒體清洗液

25 mL

50 mL

DNAI

12mg

22mg

DNA酶反應(yīng)液

6ml

12ml

線粒體裂解液

10ml

20ml

蛋白沉淀液

7.5ml

15ml

核酸助沉劑

0.5ml

1ml

TE緩沖液

15ml

30ml

二,保存條件

本試劑盒整體保存于2-8度一年。使用前,在DNAI中加入600ul50T)或者1100ul100T)的DNA酶反應(yīng)液,分裝后-20度保存。線粒體裂解液使用前常溫保存,如有沉淀可37度水浴溶解,不影響使用。

三,說明

線粒體DNA提取的關(guān)鍵是盡可能的去掉核DNA。本試劑盒利用差速離心到比較純凈的線粒體,再利用DNA酶消化裂解緩沖系統(tǒng)等多步驟去掉核DNA,zui后得到純凈的線粒體DNA。可用于PCR等對純度要求較高的實(shí)驗(yàn)。

本試劑盒用于從動物細(xì)胞或組織中分離出完整而純化的線粒體。適合于動物軟組織(肝或腦組織)和硬組織(肌肉)以及培養(yǎng)細(xì)胞線粒體DNA的提取制備。不適合植物及其他標(biāo)本的提取。

四,操作步驟

準(zhǔn)備工作:在DNAI中加入600ul50T)或者1100ul100T)的DNA酶反應(yīng)液,適當(dāng)分裝后-20度保存。線粒體裂解液保存于常溫,如有沉淀37℃水浴溶解,離心機(jī)溫度下降到4℃(2-8℃),如無低溫離心機(jī),也可以常溫離心,并將離心時間為10min的改為5min,但zui后所得DNA品質(zhì)及產(chǎn)量可能會有一定影響。

1. 樣本處理

a. 組織勻漿:稱取100~200 mg新鮮組織如肝臟、腦、心肌等,PBS或生理鹽水沖洗,洗凈血水,濾紙吸干,用剪刀剪為碎塊放入小容量玻璃勻漿器內(nèi)。加入1.0 mL冰預(yù)冷的Lysis Buffer,0冰浴上下研磨組織20次;

b. 培養(yǎng)細(xì)胞勻漿:消化細(xì)胞,PBS洗滌,800 × g 5~10 min離心收集細(xì)胞。計(jì)數(shù)。每次提取需要5 × 107個細(xì)胞,加入1.0 mL冰預(yù)冷的Lysis Buffer重懸細(xì)胞,將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到小容量玻璃勻漿器內(nèi),0冰浴研磨30~40次;

2. 將組織或細(xì)胞勻漿物轉(zhuǎn)移到離心管,4,1000× g 離心5 min

3. 取上清,加入一新的離心管中,41000× g 再次離心5 min。

4.取上清,加入一新的離心管中,4, 12,000 × g 離心10 min。離心后的上清含胞漿成分,可從中提取胞漿蛋白。將上清轉(zhuǎn)移到新離心管,線粒體沉淀在管底;

5. 在線粒體沉淀中加入0.5 mL  Wash Buffer重懸線粒體沉淀,4,1000× g 離心5 min;

6.取上清,加入一新的離心管中,4, 12,000 × g 離心10 min。棄上清,高純度的線粒體沉淀在管底;

7. 加入100ul DNA酶反應(yīng)液重懸線粒體,吹打均勻后,再加入10ul DNAI溶液(見準(zhǔn)備工作),混勻,37度水浴10min。此步為消化線粒體表面吸付的核DNA。4, 12,000 × g 離心5 min。盡可能的棄上清,再加入200ul TE 重懸線粒體沉淀,離心,洗去殘留的DNA酶。

8.得到的沉淀,用100ul TE 重懸線粒體沉淀。加入200ul線粒體裂解液,輕輕混勻(不可吹打),放置2min左右,不超過5min,再加入150ul蛋白沉淀液,迅速混勻。4 12,000 × g 離心5 min。此步驟可進(jìn)一步去除核DNA

9.取上清,加入一新的離心管中(可選用等體積的酚氯fang異戊醇25:24:1抽提一次,再用氯fang抽提一次,或者直接用氯fang抽提兩次,一般來說,此步可省,并不影響后續(xù)的PCR),加入0.6倍體積的異丙醇(如無異丙醇,可加入2.5倍體積的乙醇沉淀DNA)及10ul核酸核酸助沉劑,混勻,-20℃沉淀半小時左右(此步可?。?,4, 12,000 × g 離心10 min

10. 棄上清,再加入1ml  70%乙醇,4, 12,000 × g 離心10 min。重復(fù)用70%乙醇洗一次。

11. 棄上清后再次離心1min 吸棄上清,開蓋涼干約5-10分鐘。

12.加入20-30ul TE緩沖液,輕彈管底,37度水浴5分鐘,線粒體DNA溶解。

13. 進(jìn)行DNA電泳檢測及-20度保存,進(jìn)行下步的實(shí)驗(yàn)。

四 注意事項(xiàng):
1. 為保證獲得完整及盡可能多的線粒體,勻漿條件要示:*是全程低溫操作。第二是快速。第三,如用條件可將勻漿后的碎片在顯微鏡下觀察。與組織塊相比,培養(yǎng)細(xì)胞特別是貼壁培養(yǎng)細(xì)胞在用玻璃勻漿器勻漿時較難破壁,因而要選用小容量玻璃勻漿器、間隙嚴(yán)密的研杵上下研磨培養(yǎng)細(xì)胞。

2.線粒體DNA本身含量很低,如果電泳檢測不到,可加大上樣量,用更少量的TE溶解沉淀,或者直接進(jìn)入PCR檢測。
2. 以離心力g計(jì)算正確的離心速度,不同的離心機(jī)可據(jù)此精確計(jì)算離心速度。
 

 

一般低溫度心機(jī)都有離心力顯示,如果沒有,可以用以下公式簡單的換算。

轉(zhuǎn)速與離心力換算

G1.11×(10-5)×R×[rpm]
G為離心力,一般以g(重力加速度)的倍數(shù)來表示;

 [rpm] 即:轉(zhuǎn)速的平方; R為半徑,單位為厘米。



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