植物線粒體DNA提取試劑盒
簡(jiǎn)要描述:貨 號(hào):D0218名 稱:植物線粒體DNA提取試劑盒規(guī) 格:50T/100T價(jià) 格:1380/2560
產(chǎn)品型號(hào):
所屬分類:其他自產(chǎn)即用試劑
更新時(shí)間:2024-01-07
廠商性質(zhì):經(jīng)銷商
植物線粒體DNA提取試劑盒
一,試劑盒組份
組份 | D0218 (50T) | D0218 (100T) | 保存溫度 |
DNase I | 12mg | 22mg | -20℃ |
β-巰基乙醇 | 1ml | 1ml | 常溫,通風(fēng)處保存 |
植物細(xì)胞裂解液 | 100 mL | 200 mL | 2-8℃ |
線粒體清洗液 | 25 mL | 50 mL | 2-8℃ |
DNA酶反應(yīng)液 | 6ml | 12ml | 2-8℃ |
線粒體裂解液 | 10ml | 20ml | 常溫放置,如有沉淀可37℃水浴 |
蛋白沉淀液 | 7.5ml | 15ml | 2-8℃ |
核酸助沉劑 | 0.5ml | 1ml | 2-8℃ |
TE緩沖液 | 25ml | 50ml | 2-8℃ |
二,保存條件
本試劑盒整體保存于2-8℃一年,DNASE I -20℃保存。使用前,在DNase I中加入600ul(50T)或者1200ul(100T)的DNA酶反應(yīng)液,分裝后-20℃保存三個(gè)月,如果超過三個(gè)月,活性可能會(huì)降低,請(qǐng)自行訂購(gòu)DNASE I。線粒體裂解液使用前常溫保存,如有沉淀可37℃水浴溶解,不影響使用。
三,說明
線粒體DNA提取的關(guān)鍵是盡可能的去掉核DNA。本試劑盒利用差速離心得到比較純凈的線粒體,再利用DNA酶消化和裂解緩沖系統(tǒng)等多步驟去掉核DNA,zui后得到純凈的線粒體DNA??捎糜?/span>PCR等對(duì)純度要求較高的實(shí)驗(yàn)。
本試劑盒用于從植物葉片中分離出完整而純化的線粒體。適合于田間采摘或者實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的植物葉片中線粒體DNA的提取制備。
四,操作步驟
準(zhǔn)備工作:在DNASE I中加入600ul(50T)或者1100ul(100T)的DNA酶反應(yīng)液,適當(dāng)分裝后-20℃保存。線粒體裂解液保存于常溫,如有沉淀37℃水浴溶解,離心機(jī)溫度下降到4℃(2-8℃),如無(wú)低溫離心機(jī),也可以常溫離心,并將離心時(shí)間為10min的改為5min,但zui后所得DNA品質(zhì)及產(chǎn)量可能會(huì)有一定影響。
1. 樣本采集前處理:無(wú)論田間自然生長(zhǎng)還是實(shí)驗(yàn)室組織培養(yǎng),采摘前須避光生長(zhǎng)24-48小時(shí),以減少葉片組織中糖類及葉綠體含量。取適量植物細(xì)胞裂解液,加入0.5% β-巰基乙醇,10ml 植物細(xì)胞裂解液加入50ulβ-巰基乙醇,混勻,形成植物細(xì)胞裂解液/β-巰基乙醇溶液,此溶液可2-8度保存一個(gè)月。
2. 葉片用蒸餾水清洗2-3次,濾紙吸干,有條件請(qǐng)用液氮研磨葉片1-2克,研磨完后,取800mg左右研磨的葉片粉,加入1.5ml預(yù)冷的植物細(xì)胞裂解液/β-巰基乙醇溶液,混勻。如果無(wú)條件(無(wú)液氮),請(qǐng)預(yù)冷研缽,取洗過的葉片1000 mg,用剪刀剪為碎塊放入玻璃勻漿器或者研缽中。加入1.5ml預(yù)冷的植物細(xì)胞裂解液/β-巰基乙醇溶液,冰上研磨至看不見明顯組織塊;
3. 將研磨物放置合適的離心管,4℃,1000× g 離心5 min;
4. 將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中,在沉淀中加入0.5ml Lysis Buffer/β-巰基乙醇溶液,混勻,再次4℃,1000× g 離心5 min,取上清;合并兩次上清,將上清4℃ 1000× g 再次離心5 min。
5.取上清,加入一新的離心管中,4℃, 16,000 × g 離心10 min。離心后的上清含胞漿成分,可從中提取胞漿蛋白。將上清轉(zhuǎn)移到新離心管,線粒體沉淀在管底。
6. 在線粒體沉淀中加入0.5 mL Wash Buffer重懸線粒體沉淀,4℃,1000× g 離心5 min;
7.取上清,加入一新的離心管中,4℃, 16,000 × g 離心10 min。棄上清,高純度的線粒體沉淀在管底;
8. 加入100ul DNA酶反應(yīng)液重懸線粒體,吹打均勻后,再加入10ul DNASE I溶液(見準(zhǔn)備工作),混勻,37℃水浴10min。此步為消化線粒體表面吸付的核DNA。4℃, 12,000 × g 離心5 min。盡可能的棄上清,再加入200ul TE 重懸線粒體沉淀,4℃,12,000 × g 離心5 min,洗去殘留的DNA酶。
9.得到的沉淀,用200ul TE緩沖液重懸線粒體沉淀,加入10ul RNase A。加入200ul線粒體裂解液,輕輕混勻(不可吹打),放置1-2min,再加入150ul蛋白沉淀液,迅速混勻。4℃, 12,000 × g 離心5 min。此步驟可進(jìn)一步去除核DNA。
10.取上清,加入一新的離心管中(如用于酶切分析,可加入此步:選用等體積的酚氯f(wàn)ang異戊醇25:24:1抽提一次,再用氯f(wàn)ang抽提一次,或者直接用氯f(wàn)ang抽提兩次,一般來說,此步可去掉一些微量蛋白及糖類,但會(huì)造成線粒體DNA的損失,因而用于PCR時(shí)可省,并不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)),加入0.6倍體積的異丙醇(如無(wú)異丙醇,可加入2.5倍體積的乙醇沉淀DNA,如離心管太滿可分兩管)及5-10ul核酸核酸助沉劑,混勻,-20℃沉淀半小時(shí)左右(此步可?。?,4℃, 12,000 × g 離心10 min。
11. 棄上清,再加入1ml 70%乙醇清洗,4℃, 12,000 × g 離心5min。重復(fù)用70%乙醇洗一次。
12. 棄上清,再次離心1min 吸棄上清,不要碰到管底,開蓋涼干約5-105min。
13.加入20-30ul TE緩沖液,輕彈管底,37℃水浴5分鐘,線粒體DNA溶解。
14. 進(jìn)行DNA電泳檢測(cè)及-20℃保存,進(jìn)行下步的實(shí)驗(yàn)。
四 注意事項(xiàng):
1. 以離心力g計(jì)算正確的離心速度,不同的離心機(jī)可據(jù)此精確計(jì)算離心速度。
2. 進(jìn)行Western Blot和2D-膠電泳,可直接在第7步的沉淀中加入上樣緩沖液裂解線粒體。
3. β-巰基乙醇有毒,請(qǐng)注意通風(fēng)及防護(hù)
一般低溫度心機(jī)都有離心力顯示,如果沒有,可以用以下公式簡(jiǎn)單的換算。
G=1.11×(10-5)×R×[rpm]2
G為離心力,一般以g(重力加速度)的倍數(shù)來表示;
[rpm] 2即:轉(zhuǎn)速的平方; R為半徑,單位為厘米。
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